Rūgštinė proteazė

Taikymas ir principas

Ši rūgšties proteazė naudojama nustatant preparatų, gautų iš Aspergillus oryzae var ir Aspergillus niger var, proteolitinį aktyvumą, išreikštą hemoglobino vienetais tirozino pagrindu (HUT), ir jis gali būti naudojamas kitų proteazių aktyvumui nustatyti esant pH 4,7. . Testas pagrįstas hemoglobino substrato 30 minučių fermentine hidrolize, kai pH yra 4,7 ir 40 °. Nehidrolizuotas substratas nusodinamas trichloracto rūgštimi ir pašalinamas filtruojant. Filtrate ištirpusio hemoglobino kiekis nustatomas spektrofotometriškai.

Rūgštinės proteazės reagentai ir tirpalai
Hemoglobinas Naudokite hemoglobino substrato miltelius („Sigma Chemical Co.“, katalogo Nr. H2625) arba panašią aukštos kokybės medžiagą, kuri visiškai tirpsta vandenyje.
Acetato buferinis tirpalas 136 g natrio acetato (NaC2H3O2 · 3H2O) ištirpinkite tiek vandens, kad gautumėte 500 ml. Sumaišykite 25,0 ml šio tirpalo su 50,0 ml 1 M acto rūgšties, atskieskite vandeniu iki 1000 ml ir sumaišykite. Šio tirpalo pH turėtų būti 4,7 ± 0,02.
Substrato tirpalas 4,0 g hemoglobino perpilkite į 250 ml stiklinę, įpilkite 100 ml vandens ir maišykite 10 minučių, kad ištirptų. Panardinkite pH matuoklio elektrodus į tirpalą ir nuolat maišydami sureguliuokite pH iki 1,7, pridedant 0,3 N druskos rūgšties. Po 10 minučių pH nustatomas iki 4,7, pridedant 0,5 M natrio acetato. Tirpalas supilamas į 200 ml matavimo kolbą, praskiedžiamas vandeniu iki žymės ir sumaišomas. Laikant šaldytuve, šis tirpalas išlieka stabilus maždaug 5 dienas.
Trichloracto rūgšties tirpalas 140 g trichloracto rūgšties ištirpinkite maždaug 750 ml vandens. Tirpalas supilamas į 1000 ml matavimo kolbą, praskiedžiamas vandeniu iki žymės ir kruopščiai išmaišomas.

Mėginio paruošimas Ištirpinkite mėginio kiekį acetato buferiniame tirpale, kad gautumėte tirpalą, kuriame kiekviename ml būtų nuo 9 iki 22 HUT. (Tokia koncentracija leis absorbcijos rodmenis toliau aprašytoje procedūroje, pageidaujamame diapazone nuo 0,2 iki 0,5.)

Rūgštinės proteazės procedūra
Pipete įpilkite 10,0 ml substrato tirpalo į kiekvieną 25–150 mm mėgintuvėlių seriją: po vieną kiekvienam fermento tyrimui ir vieną - substrato tuščiajam. Vamzdelius kaitinkite vandens vonelėje 40 ° temperatūroje apie 5 min. Į kiekvieną mėgintuvėlį, išskyrus substrato ruošinį, įpilkite 2,0 ml mėginio paruošimo ir pradėkite reakcijos laiką tuo metu, kai įpilama tirpalo; į tuščią substrato mėgintuvėlį įpilkite 2,0 ml acetato buferinio tirpalo. Uždarykite mėgintuvėlius su Nr. 4 guminiais kamščiais ir 30 sekundžių švelniai bakstelėkite kiekvieną mėgintuvėlį prie delno, kad sumaišytumėte. Kiekvieną mėgintuvėlį šildykite vandens vonelėje 40 ° temperatūroje tiksliai 30 minučių, tada į kiekvieną mėgintuvėlį greitai įpurškite 10,0 ml trichloracto rūgšties tirpalo. Kiekvieną mėgintuvėlį apie 40 sekundžių stipriai purtykite nuo kamščio ir palikite 1 valandą atvėsti iki kambario temperatūros, tuo laikotarpiu kiekvieną mėgintuvėlį 10-12 minučių pertraukdami. Paruoškite fermentų ruošinius taip: Atskiruose mėgintuvėliuose 30 minučių vandens vonelėje pašildykite 10,0 ml substrato tirpalo ir maždaug 5 ml mėginio preparato, tada į substrato tirpalą įpilkite 10,0 ml trichloracto rūgšties tirpalo, gerai suplakite. 40 sekundžių ir į šį mišinį įpilkite 2,0 ml iš anksto pašildyto mėginio paruošimo. Pakratykite dar kartą ir atvėsinkite kambario temperatūroje 1 valandą, purtydami 10–12 minučių intervalais.
Praėjus 1 valandai, kiekvieną mėgintuvėlį stipriai purtykite ir filtruokite per 11 cm „Whatman No. 42“ arba lygiavertį filtravimo popierių, pirmąją filtrato pusę filtruodami per tą patį popierių. Kiekvieno filtrato absorbcija 1 cm kameroje, esant 275 nm bangos ilgiui, nustatoma tinkamu spektrofotometru, naudojant filtrą iš tuščiojo substrato, kad prietaisas būtų nulis. Ištaisykite kiekvieną rodmenį, atimdami atitinkamą fermento tuščią reikšmę ir taip gautą vertę užrašykite kaip AU.
[Pastaba: Jei koreguotos absorbcijos rodmenys tarp 0,2 ir 0,5 negaunami, pakartokite bandymą, jei reikia, daugiau ar mažiau fermento preparato.]

Standartinė kreivė Perkelkite 100,0 mg chromatografinio laipsnio arba lygiaverčio L-tirozino („Aldrich Chemical Co.“), anksčiau išdžiovinto iki pastovaus svorio, į 1000 ml matavimo kolbą. Ištirpinkite 60 ml 0,1 N druskos rūgšties. Kai L-tirozenas visiškai ištirps, tirpalą atskieskite vandeniu iki žymės ir kruopščiai sumaišykite. Šiame tirpale yra 100 µg tirozino 1,0 ml. Iš šio pradinio tirpalo paruoškite dar tris praskiedimus, kad viename mililitre būtų 75,0, 50,0 ir 25,0 µg tirozino. Tinkamo spektrofotometro pagalba nustatykite keturių tirpalų absorbciją esant 275 nm 1 cm ilgio ląstelėje, palyginti su 0,006 N druskos rūgštimi. Paruoškite absorbcijos ir tirozino koncentracijos diagramą. Nustatykite kreivės nuolydį pagal absorbciją 1 μg tirozino. Padauginkite šią vertę iš 1,10 ir įrašykite ją kaip AS. Reikėtų gauti maždaug 0,0084 vertę.

Rūgštinės proteazės apskaičiavimas
Vienas HUT proteolizės vienetas (rūgšties proteazė) aktyvumas apibrėžiamas kaip tas fermento kiekis, kuris per 1 min. nurodytomis sąlygomis sukuria hidrolizatą, kurio absorbcija ties 275 nm yra tokia pati kaip tirpalo, kuriame yra 1,10 µg / ml tirozino 0,006 N druskos rūgštyje.
Apskaičiuokite HUT už 1 g pirminio fermento preparato pagal lygtį

HUT / g = (AU / AS) (22 / 30W)

kuriame 22 yra galutinis tiriamojo tirpalo tūris; 30 yra reakcijos laikas, minutėmis; ir W yra paimto pradinio mėginio svoris gramais.

[Pastaba: AS vertė kruopščiai kontroliuojamomis ir standartizuotomis sąlygomis yra 0,0084; ši vertė gali būti naudojama įprastam darbui vietoj vertės, gautos iš standartinės kreivės, tačiau tikslesniam rezultatui ir abejonių atveju turėtų būti naudojama tiksli vertė, apskaičiuota pagal standartinę kreivę.]

ANALIZĖS SERTIFIKATAS

produkto pavadinimas	Rūgštinė proteazė
Kitas vardas	Nėra	Kilmės šalis	Kinija
Perkošti	Aspergillus oryzae	Pagaminimo data	2019 m. Gegužės 13 d
Partijos numeris	SP19050903	Galiojimo laikas	2021 GEGUŽĖS 12 d
Pakuotė	25 kg / kibiras	Kiekis	100 kg
PROTOKOLAS	SPECIFIKACIJOS	REZULTATAI	METODAS
FIZINĖ IR CHEMINĖ ANALIZĖ
apibūdinimas	rudi milteliai	Atitinka	Vaizdinis
Kvapas ir skonis	Būdingas kvapas ir skonis	Atitinka	Skonis
Drėgmė	NMT 7%	5,1%	Drėgmės analizatorius
IDENTIFIKAVIMAS
Identifikuojama veikla	Teigiamas Bromelaino aktyvumas	Atitinka	Viduje
VEIKLA
Proteazės veikla	500 000 NLT / g NLT	508 270 HUT / g	FCC VII
MIKROBIOLOGINĖ
Bendras bakterijų skaičius Koliforminės bakterijos (CFU / g) Pelėsiai ir mielės E.Coli Salmonelės Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa	NMT 3000 CFU / g NMT 30 CFU / g NMT 100 CFU / g Nėra Nėra Nėra Nėra	500 CFU / g 10 CFU / g 10 CFU / g Neaptiktas Neaptiktas Neaptiktas Neaptiktas	FDA BAM internetinis skyrius 3 FDA BAM internetinis skyrius 4 FDA BAM Online Ch. 2 FDA BAM internetinis skyrius 4 FDA BAM Online Ch.5 FDA BAM internetinis skyrius 12 AOAC
SUNKIEJI METALAI
Vadovauti Merkurijus Kadmis Arsenas	NMT 3 ppm NMT 0,1 ppm NMT 1 ppm NMT 1 ppm	0,21 ppm 0,1 ppm 1 ppm 1 ppm	USP <231> USP <231> USP <231> USP <231>
Laikymas: Laikykite vėsioje ir sausoje vietoje, apsaugotoje nuo šviesos, laikykite būgną šalia, kai jo nenaudojate. Išvada: Atitinka IU standartus. Tinkamumo laikas: rūgšties proteazės tinkamumo laikas nustatytomis laikymo sąlygomis ir sandarioje pakuotėje bus 2 metai. Produktas ATITIKTA pirmiau nurodytų specifikacijų Patvirtino RICKY H. ZHU įgaliotasis signataras

*The above information is a direct translation of the information provided to Newgen Biotech from the manufacturer of rūgšties proteazė. This Certificate of Analysis should be used for informational purposes and is not intended as a substitute for strict quality control analysis by the purchaser of this product.

Pakavimas ir sandėliavimas

Kietas maisto pakavimo maišas, 25 kg / statinė.

Rūgštinę proteazę reikia laikyti sausose, vėsiose ir gerai vėdinamose vietose nuo saulės, karščio.

Apmokėjimas:T / T, „Paypal“, „Western Union“, „Alibaba Trade Assurance“, „VISA“, „MasterCard“, el. Patikrinimas, mokėjimas vėliau, LC ir kt.