Šarminė proteazė

Taikymas ir principas

Ši šarminė proteazė naudojama nustatant preparatų, gautų iš Bacillus subtilis var., Proteazės aktyvumą, išreikštą PC vienetais. ir Bacillus licheniformis var. Tyrimas pagrįstas kazeino 30 minučių proteolitine hidrolize esant 37 ° ir pH 7,0. Nehidrolizuotas kazeinas pašalinamas filtruojant, o ištirpęs kazeinas nustatomas spektrofotometriškai.

Šarminės proteazės reagentai ir tirpalai
Kazeinas Naudokite „Hammarsten“ klasės kazeiną („United States Biochemical Corp.“, katalogo Nr. 12840 arba lygiavertį).
Tris buferis (pH 7,0) 12,1 g fermentinio laipsnio (arba lygiaverčio) tris (hidroksimetil) aminometano ištirpinkite 800 ml vandens ir titruokite 1 N druskos rūgštimi iki pH 7,0. Perkelkite į 1000 ml matavimo kolbą, atskieskite vandeniu iki žymės ir sumaišykite.
TCA tirpalas Ištirpinkite 18 g trichloracto rūgšties ir 19 g natrio acetato trihidrato 800 ml vandens 1000 ml matavimo kolboje, įpilkite 20 ml ledinės acto rūgšties, atskieskite iki vandens ir sumaišykite.
Substrato tirpalas 6,05 g fermentinio laipsnio tris (hidroksimetil) aminometano ištirpinkite 500 ml vandens, įpilkite 8 ml 1 N druskos rūgšties ir sumaišykite. Šiame tirpale ištirpinkite 7 g kazeino ir 30 minučių kaitinkite verdančio vandens vonelėje, kartais maišydami.
Atvėsinkite iki kambario temperatūros ir sureguliuokite iki pH 7,0 0,2 N druskos rūgštimi, lėtai, stipriai maišydami, įpilkite rūgšties, kad būtų išvengta kazeino nuosėdų. Mišinys supilamas į 1000 ml matavimo kolbą, praskiedžiamas vandeniu iki žymės ir sumaišomas.

Mėginio paruošimas naudojant Tris buferį paruoškite mėginio fermento preparato tirpalą, kad 2 ml galutinio praskiedimo būtų nuo 10 iki 44 bakterijų proteazių vienetų.

Šarminės proteazės procedūra
Į kiekvieną 25–150 mm mėgintuvėlių seriją pipete įpilkite 10,0 ml substrato tirpalo, po vieną mėgintuvėlį kiekvienam fermento tyrimui, po vieną mėgintuvėlį kiekvienam fermento ruošiniui ir vieną mėgintuvėlį substrato ruošiniui. Mėgintuvėlius 15 minučių subalansuokite vandens vonioje, kurioje palaikoma 37 ° ± 0,1 °.
Pradėdami chronometrą nuliu, greitai į pipetę įpilkite 2,0 ml mėginio preparato. Sumaišykite ir pakeiskite mėgintuvėlius vandens vonelėje. Į substrato ruošinį įpilkite 2 ml Tris buferio (vietoj mėginio paruošimo). Praėjus lygiai 30 minučių, į kiekvieną fermento inkubaciją įpilkite 10 ml TCA tirpalo ir į tuščią substratą, kad reakcija būtų sustabdyta. Vamzdelius dar 30 minučių pašildykite vandens vonelėje, kad baltymai visiškai susikauptų.
Antrojo kaitinimo laikotarpio pabaigoje stipriai purtykite kiekvieną mėgintuvėlį ir filtruokite per 11 cm „Whatman No. 42“ arba lygiavertį filtravimo popierių, išmesdami pirmuosius 3 ml filtrato.
[Pastaba: filtratas turi būti visiškai skaidrus.]
Kiekvieno mėginio filtrato absorbcija nustatoma 1 cm ilgio ląstelėje, esant 275 nm bangos ilgiui, naudojant tinkamą spektrofotometrą, naudojant filtrą iš substrato ruošinio, kad prietaisas būtų nulis. Ištaisykite kiekvieną rodmenį, atimdami atitinkamą fermento tuščią reikšmę ir taip gautą vertę užrašykite kaip AU.

Standartinė kreivė Perkelkite 100,0 mg chromatografinio ar lygiaverčio L-tirozino („Aldrich Chemical Co.“), anksčiau išdžiovinto iki pastovios masės, į 1000 ml matavimo kolbą. Ištirpinkite 60 ml 0,1 N druskos rūgšties. Kai visiškai ištirps, tirpalą atskieskite vandeniu iki žymės ir kruopščiai sumaišykite. Šiame tirpale yra 100 µg tirozino 1,0 ml. Iš šio pradinio tirpalo paruoškite dar tris praskiedimus, kad viename mililitre būtų 75,0, 50,0 ir 25,0 µg tirozino. Tinkamo spektrofotometro pagalba nustatykite keturių tirpalų absorbciją esant 275 nm 1 cm ilgio ląstelėje, palyginti su 0,006 N druskos rūgštimi. Paruoškite absorbcijos ir tirozino koncentracijos diagramą.

Šarminės proteazės apskaičiavimas
Vienas bakterinės proteazės vienetas (PK) apibrėžiamas kaip tas fermento kiekis, kuris tyrimo sąlygomis gamina 1,5 µg / ml L-tirozino ekvivalentą per minutę.
Pagal standartinę kreivę ir interpoliuodami nustatykite tirpalo, kurio tirozino koncentracija yra 60 μg / ml, absorbciją. Turėtų būti gautas skaičius, artimas 0,0115. Padalinkite interpoluotą vertę iš 40, kad gautumėte absorbciją, lygiavertę tirpalo, kurio tirozino koncentracija yra 1,5 µg / ml, absorbcijai ir taip gautą vertę užrašykite kaip AS.
Apskaičiuokite mėginio fermento preparato aktyvumą pagal lygtį

PC / g = (AU / AS) × (22 / 30W)

kurioje 22 yra galutinis reakcijos mišinio tūris ml; 30 yra reakcijos laikas minutėmis; ir W yra paimto pradinio mėginio svoris gramais.

Šarminės proteazės pakavimas ir laikymas

Kietas maisto pakavimo maišas, 25 kg / statinė.

Šarminę proteazę reikia laikyti sausose, vėsiose ir gerai vėdinamose vietose nuo saulės, karščio.

Apmokėjimas:T / T, „Paypal“, „Western Union“, „Alibaba Trade Assurance“, „VISA“, „MasterCard“, el. Patikrinimas, mokėjimas vėliau, LC ir kt.